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Javier Fidalgo, * Pierre-Antoine Deglesne, * Rodrigo Arroyo, * Lilian Sepúlveda, * Evgeniya Ranneva, Dipartimento di Scienze Philippe Deprez, Skin Tech Pharma Group, Castello D'Empúries, Catalogna, Spagna * Questi autori hanno alcune informazioni su questo lavoro Equal background del contributo: L'acido ialuronico (HA) è un polisaccaride naturale utilizzato nella produzione di filler dermici per scopi estetici.Poiché ha un'emivita di diversi giorni nei tessuti umani, i filler dermici a base di HA vengono modificati chimicamente per prolungarne la vita nel corpo.La modifica più comune nei riempitivi commerciali a base di HA è l'uso di 1,4-butandiol diglicidil etere (BDDE) come agente reticolante per reticolare le catene di HA.Il BDDE residuo o non reagito è considerato non tossico a <2 parti per milione (ppm);pertanto, il BDDE residuo nel filler dermico finale deve essere quantificato per garantire la sicurezza del paziente.Materiali e metodi: questo studio descrive il rilevamento e la caratterizzazione di un sottoprodotto della reazione di reticolazione tra BDDE e HA in condizioni alcaline combinando cromatografia liquida e spettrometria di massa (LC-MS).Risultati: Dopo diverse analisi, è stato riscontrato che le condizioni alcaline e l'elevata temperatura utilizzate per disinfettare l'idrogel HA-BDDE hanno promosso la formazione di questo nuovo sottoprodotto, il composto "simile al glicole propilenico".L'analisi LC-MS ha confermato che il sottoprodotto ha la stessa massa monoisotopica del BDDE, un diverso tempo di ritenzione (tR) e una diversa modalità di assorbimento UV (λ=200 nm).A differenza del BDDE, nell'analisi LC-MS è stato osservato che nelle stesse condizioni di misurazione, questo sottoprodotto ha un tasso di rilevamento più elevato a 200 nm.Conclusione: questi risultati indicano che non c'è epossido nella struttura di questo nuovo composto.La discussione è aperta per valutare il rischio di questo nuovo sottoprodotto che si trova nella produzione dell'idrogel HA-BDDE (filler dermico HA) per scopi commerciali.Parole chiave: acido ialuronico, filler dermico HA, acido ialuronico reticolato, BDDE, analisi LC-MS, sottoprodotto BDDE.
I filler a base di acido ialuronico (HA) sono i filler dermici più comuni e popolari utilizzati per scopi cosmetici.1 Questo filler dermico è un idrogel, solitamente composto da >95% di acqua e 0,5-3% di HA, che conferisce loro una struttura gelatinosa.2 HA è un polisaccaride e il componente principale della matrice extracellulare dei vertebrati.Uno degli ingredientiÈ costituito da unità disaccaridiche ripetute dell'acido (1,4)-glucuronico-β (1,3)-N-acetilglucosamina (GlcNAc) collegate da legami glicosidici.Questo modello disaccaride è lo stesso in tutti gli organismi.Rispetto ad alcuni filler a base di proteine (come il collagene), questa proprietà rende l'HA una molecola altamente biocompatibile.Questi riempitivi possono mostrare specificità di sequenza di amminoacidi che possono essere riconosciute dal sistema immunitario del paziente.
Quando viene utilizzato come filler dermico, il principale limite dell'HA è il suo rapido ricambio all'interno dei tessuti dovuto alla presenza di una specifica famiglia di enzimi chiamati ialuronidasi.Finora, sono state descritte diverse modifiche chimiche nella struttura dell'HA per aumentare l'emivita dell'HA nei tessuti.3 La maggior parte di queste modifiche tenta di ridurre l'accesso della ialuronidasi ai polimeri polisaccaridi mediante reticolazione delle catene di HA.Pertanto, a causa della formazione di ponti e dei legami covalenti intermolecolari tra la struttura dell'HA e l'agente di reticolazione, l'idrogel di HA reticolato produce più prodotti di degradazione dell'antienzima rispetto all'HA naturale.4-6
Finora, gli agenti reticolanti chimici utilizzati per produrre HA reticolato includono metacrilamide, 7 idrazide, 8 carbodiimmide, 9 divinilsolfone, 1,4-butandiol diglicidil etere (BDDE) e poli(etilenglicole) diglicidil etere.10,11 BDDE è attualmente l'agente reticolante più comunemente usato.Sebbene questi tipi di idrogel si siano dimostrati sicuri da decenni, gli agenti reticolanti utilizzati sono reagenti reattivi che possono essere citotossici e, in alcuni casi, mutageni.12 Pertanto, il loro contenuto residuo nell'idrogel finale deve essere elevato.Il BDDE è considerato sicuro quando la concentrazione residua è inferiore a 2 parti per milione (ppm).4
Esistono diversi metodi per rilevare la concentrazione di BDDE a basso residuo, il grado di reticolazione e la posizione di sostituzione negli idrogel di HA, come la gascromatografia, la cromatografia ad esclusione dimensionale accoppiata con la spettrometria di massa (MS), i metodi di misurazione della fluorescenza della risonanza magnetica nucleare (NMR) e Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC) accoppiata a serie di diodi.13-17 Questo studio descrive il rilevamento e la caratterizzazione di un sottoprodotto nell'idrogel di HA reticolato finale prodotto dalla reazione di BDDE e HA in condizioni alcaline.HPLC e cromatografia liquida-spettrometria di massa (analisi LC-MS).Poiché la tossicità di questo sottoprodotto del BDDE è sconosciuta, si consiglia di determinarne la quantificazione del residuo in modo simile al metodo normalmente eseguito sul BDDE nel prodotto finale.
Il sale di sodio di HA ottenuto (Shiseido Co., Ltd., Tokyo, Giappone) ha un peso molecolare di ~1.368.000 Da (metodo Laurent) 18 e una viscosità intrinseca di 2,20 m3/kg.Per la reazione di reticolazione, BDDE (≥95%) è stato acquistato da Sigma-Aldrich Co. (St. Louis, MO, USA).La soluzione salina tamponata con fosfato con pH 7,4 è stata acquistata dalla Sigma-Aldrich Company.Tutti i solventi, l'acetonitrile e l'acqua utilizzati nell'analisi LC-MS sono stati acquistati da HPLC grade quality.L'acido formico (98%) viene acquistato come grado di reagente.
Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti su un sistema UPLC Acquity (Waters, Milford, MA, USA) e collegati a uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo API 3000 dotato di una sorgente di ionizzazione elettrospray (AB SCIEX, Framingham, MA, USA).
La sintesi di idrogel di HA reticolato è stata avviata aggiungendo 198 mg di BDDE a una soluzione di ialuronato di sodio (NaHA) al 10% (p/p) in presenza di alcali all'1% (idrossido di sodio, NaOH).La concentrazione finale di BDDE nella miscela di reazione era 9,9 mg/mL (0,049 mM).Quindi, la miscela di reazione è stata accuratamente miscelata e omogeneizzata e fatta procedere a 45°C per 4 ore.19 Il pH della reazione viene mantenuto a ~12.
Successivamente, la miscela di reazione è stata lavata con acqua e l'idrogel HA-BDDE finale è stato filtrato e diluito con tampone PBS per ottenere una concentrazione di HA da 10 a 25 mg/mL e un pH finale di 7,4.Per sterilizzare gli idrogel di HA reticolato prodotti, tutti questi idrogel vengono sterilizzati in autoclave (120°C per 20 minuti).L'idrogel BDDE-HA purificato viene conservato a 4°C fino all'analisi.
Per analizzare il BDDE presente nel prodotto HA reticolato, un campione da 240 mg è stato pesato e introdotto nel foro centrale (Microcon®; Merck Millipore, Billerica, MA, USA; volume 0,5 mL) e centrifugato a 10.000 rpm a temperatura ambiente 10 minuti.Sono stati raccolti e analizzati un totale di 20 µl di liquido pull-down.
Per analizzare lo standard BDDE (Sigma-Aldrich Co) in condizioni alcaline (1%, 0,1% e 0,01% NaOH), se sono soddisfatte le seguenti condizioni, il campione liquido è 1:10, 1:100 o fino a 1:1.000.000 Se necessario, utilizzare acqua deionizzata MilliQ per l'analisi.
Per i materiali di partenza utilizzati nella reazione di reticolazione (HA 2%, H2O, 1% NaOH e 0,049 mM BDDE), 1 mL di ciascun campione preparato da questi materiali è stato analizzato utilizzando le stesse condizioni di analisi.
Per determinare la specificità dei picchi che appaiono nella mappa ionica, al campione da 20 µl sono stati aggiunti 10 µl di soluzione standard di BDDE da 100 ppb (Sigma-Aldrich Co).In questo caso, la concentrazione finale dello standard in ciascun campione è 37 ppb.
Innanzitutto, preparare una soluzione madre BDDE con una concentrazione di 11.000 mg/L (11.000 ppm) diluendo 10 μL di BDDE standard (Sigma-Aldrich Co) con 990 μL di acqua MilliQ (densità 1,1 g/mL).Utilizzare questa soluzione per preparare una soluzione di BDDE da 110 µ g/L (110 ppb) come diluizione standard intermedia.Quindi, utilizzare il diluente standard BDDE intermedio (110 ppb) per preparare la curva standard diluendo il diluente intermedio più volte per ottenere la concentrazione desiderata di 75, 50, 25, 10 e 1 ppb.Come mostrato nella Figura 1, si trova che la curva standard BDDE da 1,1 a 110 ppb ha una buona linearità (R2>0,99).La curva standard è stata ripetuta in quattro esperimenti indipendenti.
Figura 1 Curva di calibrazione standard BDDE ottenuta mediante analisi LC-MS, in cui si osserva una buona correlazione (R2>0,99).
Abbreviazioni: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil etere;LC-MS, cromatografia liquida e spettrometria di massa.
Al fine di identificare e quantificare gli standard BDDE presenti nell'HA reticolato e gli standard BDDE nella soluzione base, è stata utilizzata l'analisi LC-MS.
La separazione cromatografica è stata ottenuta su una colonna LUNA 2,5 µm C18(2)-HST (50×2,0 mm2; Phenomenex, Torrance, CA, USA) e mantenuta a temperatura ambiente (25°C) durante l'analisi.La fase mobile è costituita da acetonitrile (solvente A) e acqua (solvente B) contenente lo 0,1% di acido formico.La fase mobile viene eluita mediante eluizione a gradiente.La pendenza è la seguente: 0 minuti, 2% A;1 minuto, 2% A;6 minuti, 98% A;7 minuti, 98% A;7,1 minuti, 2% A;10 minuti, 2% A. Il tempo di esecuzione è di 10 minuti e il volume di iniezione è di 20 µL.Il tempo di ritenzione del BDDE è di circa 3,48 minuti (da 3,43 a 4,14 minuti in base agli esperimenti).La fase mobile è stata pompata a una portata di 0,25 mL/min per l'analisi LC-MS.
Per l'analisi e la quantificazione del BDDE mediante MS, il sistema UPLC (Waters) è combinato con uno spettrometro di massa a triplo quadrupolo API 3000 (AB SCIEX) dotato di una sorgente di ionizzazione elettrospray e l'analisi viene eseguita in modalità a ioni positivi (ESI+).
Secondo l'analisi del frammento ionico eseguita su BDDE, il frammento con la massima intensità è stato determinato come il frammento corrispondente a 129,1 Da (Figura 6).Pertanto, nella modalità di monitoraggio multi-ione (MIM) per la quantificazione, la conversione di massa (rapporto massa-carica [m/z]) di BDDE è 203,3/129,1 Da.Utilizza anche la modalità full scan (FS) e la modalità Product Ion Scan (PIS) per l'analisi LC-MS.
Per verificare la specificità del metodo è stato analizzato un campione bianco (fase mobile iniziale).Nessun segnale è stato rilevato nel campione bianco con una conversione di massa di 203,3/129,1 Da.Per quanto riguarda la ripetibilità dell'esperimento, sono state analizzate 10 iniezioni standard di 55 ppb (al centro della curva di calibrazione), risultando in una deviazione standard residua (RSD) <5% (dati non mostrati).
Il contenuto residuo di BDDE è stato quantificato in otto diversi idrogel di HA reticolati con BDDE sterilizzati in autoclave, corrispondenti a quattro esperimenti indipendenti.Come descritto nella sezione “Materiali e metodi”, la quantificazione è valutata dal valore medio della curva di regressione della diluizione standard BDDE, che corrisponde al picco unico rilevato alla transizione di massa BDDE di 203,3/129,1 Da, con una ritenzione tempo da 3,43 a 4,14 minuti Non in attesa.La Figura 2 mostra un cromatogramma di esempio dello standard di riferimento BDDE da 10 ppb.La tabella 1 riassume il contenuto residuo di BDDE di otto diversi idrogel.L'intervallo di valori è compreso tra 1 e 2,46 ppb.Pertanto, la concentrazione residua di BDDE nel campione è accettabile per l'uso umano (<2 ppm).
Figura 2 Cromatogramma ionico di 10 ppb BDDE standard di riferimento (Sigma-Aldrich Co), transizione MS (m/z) ottenuta mediante analisi LC-MS di 203,30/129,10 Da (in modalità MRM positiva).
Abbreviazioni: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil etere;LC-MS, cromatografia liquida e spettrometria di massa;MRM, monitoraggio di reazioni multiple;SM, massa;m/z, rapporto massa-carica.
Nota: i campioni 1-8 sono idrogel di HA reticolato in autoclave con BDDE.Vengono inoltre riportati la quantità residua di BDDE nell'idrogel e il picco del tempo di ritenzione del BDDE.Infine viene segnalata anche l'esistenza di nuovi picchi con tempi di ritenzione differenti.
Abbreviazioni: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil etere;HA, acido ialuronico;MRM, monitoraggio di reazioni multiple;tR, tempo di ritenzione;LC-MS, cromatografia liquida e spettrometria di massa;RRT, tempo di ritenzione relativo.
Sorprendentemente, l'analisi del cromatogramma ionico LC-MS ha mostrato che sulla base di tutti i campioni di idrogel di HA reticolato in autoclave analizzati, c'era un picco aggiuntivo al tempo di ritenzione più breve da 2,73 a 3,29 minuti.Ad esempio, la Figura 3 mostra il cromatogramma ionico di un campione di HA reticolato, in cui un picco aggiuntivo appare con un diverso tempo di ritenzione di circa 2,71 minuti.Il tempo di ritenzione relativo osservato (RRT) tra il picco appena osservato e il picco di BDDE è risultato essere 0,79 (Tabella 1).Poiché sappiamo che il picco appena osservato è meno trattenuto nella colonna C18 utilizzata nell'analisi LC-MS, il nuovo picco può corrispondere a un composto più polare del BDDE.
Figura 3 Cromatogramma ionico del campione di idrogel HA reticolato ottenuto mediante LC-MS (conversione di massa MRM 203,3/129,0 Da).
Abbreviazioni: HA, acido ialuronico;LC-MS, cromatografia liquida e spettrometria di massa;MRM, monitoraggio di reazioni multiple;RRT, tempo di ritenzione relativo;tR, tempo di ritenzione.
Al fine di escludere la possibilità che i nuovi picchi osservati possano essere contaminanti originariamente presenti nelle materie prime utilizzate, anche queste materie prime sono state analizzate utilizzando lo stesso metodo di analisi LC-MS.I materiali di partenza analizzati includono acqua, 2% NaHA in acqua, 1% NaOH in acqua e BDDE alla stessa concentrazione utilizzata nella reazione di reticolazione.Il cromatogramma ionico del materiale di partenza utilizzato non ha mostrato alcun composto o picco e il suo tempo di ritenzione corrisponde al nuovo picco osservato.Questo fatto scarta l'idea che non solo il materiale di partenza possa contenere composti o sostanze che potrebbero interferire con la procedura di analisi, ma non vi è alcun segno di possibile contaminazione incrociata con altri prodotti di laboratorio.I valori di concentrazione ottenuti dopo l'analisi LC-MS di BDDE e nuovi picchi sono mostrati nella Tabella 2 (campioni 1-4) e il cromatogramma ionico nella Figura 4.
Nota: i campioni 1-4 corrispondono alle materie prime utilizzate per produrre idrogel HA reticolato BDDE in autoclave.Questi campioni non sono stati sterilizzati in autoclave.
Abbreviazioni: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil etere;HA, acido ialuronico;LC-MS, cromatografia liquida e spettrometria di massa;MRM, monitoraggio di reazioni multiple.
La figura 4 corrisponde al cromatogramma LC-MS di un campione della materia prima utilizzata nella reazione di reticolazione di HA e BDDE.
Nota: tutti questi sono misurati alla stessa concentrazione e rapporto utilizzati per eseguire la reazione di reticolazione.I numeri delle materie prime analizzate dal cromatogramma corrispondono a: (1) acqua, (2) soluzione acquosa di HA al 2%, (3) soluzione acquosa di NaOH all'1%.L'analisi LC-MS viene eseguita per la conversione di massa di 203,30/129,10 Da (in modalità MRM positiva).
Abbreviazioni: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil etere;HA, acido ialuronico;LC-MS, cromatografia liquida e spettrometria di massa;MRM, monitoraggio di reazioni multiple.
Sono state studiate le condizioni che hanno portato alla formazione di nuovi picchi.Per studiare come le condizioni di reazione utilizzate per produrre l'idrogel di HA reticolato influenzino la reattività dell'agente reticolante BDDE, portando alla formazione di nuovi picchi (possibili sottoprodotti), sono state eseguite diverse misurazioni.In queste determinazioni, abbiamo studiato e analizzato il reticolante BDDE finale, che è stato trattato con diverse concentrazioni di NaOH (0%, 1%, 0,1% e 0,01%) in un mezzo acquoso, seguito da o senza sterilizzazione in autoclave.La procedura batterica per simulare le stesse condizioni è la stessa del metodo utilizzato per produrre l'idrogel di HA reticolato.Come descritto nella sezione "Materiali e metodi", la transizione di massa del campione è stata analizzata mediante LC-MS a 203.30/129.10 Da.Vengono calcolati il BDDE e la concentrazione del nuovo picco e i risultati sono riportati nella Tabella 3. Non sono stati rilevati nuovi picchi nei campioni non sterilizzati in autoclave, indipendentemente dalla presenza di NaOH nella soluzione (campioni 1-4, Tabella 3).Per i campioni sterilizzati in autoclave, i nuovi picchi vengono rilevati solo in presenza di NaOH nella soluzione e la formazione del picco sembra dipendere dalla concentrazione di NaOH nella soluzione (campioni 5-8, Tabella 3) (RRT = 0,79).La Figura 5 mostra un esempio di cromatogramma ionico, che mostra due campioni sterilizzati in autoclave in presenza o assenza di NAOH.
Abbreviazioni: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil etere;LC-MS, cromatografia liquida e spettrometria di massa;MRM, monitoraggio di reazioni multiple.
Nota: il cromatogramma superiore: il campione è stato trattato con una soluzione acquosa di NaOH allo 0,1% e sterilizzato in autoclave (120°C per 20 minuti).Cromatogramma inferiore: il campione non è stato trattato con NaOH, ma sterilizzato in autoclave nelle stesse condizioni.La conversione di massa di 203,30/129,10 Da (in modalità MRM positiva) è stata analizzata mediante LC-MS.
Abbreviazioni: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil etere;LC-MS, cromatografia liquida e spettrometria di massa;MRM, monitoraggio di reazioni multiple.
In tutti i campioni sterilizzati in autoclave, con o senza NaOH, la concentrazione di BDDE è stata notevolmente ridotta (fino a 16,6 volte) (campioni 5-8, tabella 2).La diminuzione della concentrazione di BDDE può essere dovuta al fatto che a temperature elevate, l'acqua può fungere da base (nucleofila) per aprire l'anello epossidico del BDDE per formare un composto 1,2-diolo.La qualità monoisotopica di questo composto è diversa da quella del BDDE e quindi non ne risentirà.LC-MS ha rilevato uno spostamento di massa di 203.30/129.10 Da.
Infine, questi esperimenti mostrano che la generazione di nuovi picchi dipende dalla presenza di BDDE, NAOH e dal processo di sterilizzazione in autoclave, ma non ha nulla a che fare con HA.
Il nuovo picco trovato ad un tempo di ritenzione di circa 2,71 minuti è stato quindi caratterizzato da LC-MS.A tale scopo, il BDDE (9,9 mg/mL) è stato incubato in una soluzione acquosa di NaOH all'1% e sterilizzato in autoclave.Nella Tabella 4, le caratteristiche del nuovo picco sono confrontate con il noto picco di riferimento BDDE (tempo di ritenzione di circa 3,47 minuti).Sulla base dell'analisi della frammentazione ionica dei due picchi, si può concludere che il picco con un tempo di ritenzione di 2,72 minuti mostra gli stessi frammenti del picco BDDE, ma con intensità diverse (Figura 6).Per il picco corrispondente al tempo di ritenzione (PIS) di 2,72 minuti, è stato osservato un picco più intenso dopo la frammentazione a una massa di 147 Da.Alla concentrazione di BDDE (9,9 mg/mL) utilizzata in questa determinazione, sono state osservate anche diverse modalità di assorbimento (UV, λ=200 nm) nello spettro ultravioletto dopo la separazione cromatografica (Figura 7).Il picco con un tempo di ritenzione di 2,71 minuti è ancora visibile a 200 nm, mentre il picco BDDE non può essere osservato nel cromatogramma nelle stesse condizioni.
Tabella 4 Risultati della caratterizzazione del nuovo picco con un tempo di ritenzione di circa 2,71 minuti e del picco BDDE con un tempo di ritenzione di 3,47 minuti
Nota: per ottenere questi risultati, sono state eseguite analisi LC-MS e HPLC (MRM e PIS) sui due picchi.Per l'analisi HPLC viene utilizzata la rivelazione UV con una lunghezza d'onda di 200 nm.
Abbreviazioni: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil etere;HPLC, cromatografia liquida ad alte prestazioni;LC-MS, cromatografia liquida e spettrometria di massa;MRM, monitoraggio di reazioni multiple;m/z, rapporto massa/carica;PIS, prodotto Scansione ionica;luce ultravioletta, luce ultravioletta.
Nota: i frammenti di massa sono ottenuti mediante analisi LC-MS (PIS).Cromatogramma superiore: spettro di massa dei frammenti del campione standard BDDE.Cromatogramma inferiore: lo spettro di massa del nuovo picco rilevato (RRT associato al picco BDDE è 0,79).Il BDDE è stato processato in una soluzione di NaOH all'1% e sterilizzato in autoclave.
Abbreviazioni: BDDE, 1,4-butandiol diglicidil etere;LC-MS, cromatografia liquida e spettrometria di massa;MRM, monitoraggio di reazioni multiple;PIS, scansione ionica del prodotto;RRT, tempo di ritenzione relativo.
Figura 7 Cromatogramma ionico dello ione precursore 203,30 Da e (A) il nuovo picco con un tempo di ritenzione di 2,71 minuti e (B) il rilevamento UV del picco dello standard di riferimento BDDE a 3,46 minuti a 200 nm.
In tutti gli idrogel HA reticolati prodotti, è stato osservato che la concentrazione residua di BDDE dopo la quantificazione LC-MS era <2 ppm, ma nell'analisi è apparso un nuovo picco sconosciuto.Questo nuovo picco non corrisponde al prodotto standard BDDE.Anche il prodotto standard BDDE ha subito la stessa analisi di conversione della qualità (conversione MRM 203.30/129.10 Da) nella modalità MRM positiva.Generalmente, altri metodi analitici come la cromatografia vengono utilizzati come test limite per rilevare il BDDE negli idrogel, ma il limite massimo di rilevamento (LOD) è leggermente inferiore a 2 ppm.D'altra parte, finora, NMR e MS sono stati utilizzati per caratterizzare il grado di reticolazione e/o modifica di HA nei frammenti di unità zuccherine di prodotti HA reticolati.Lo scopo di queste tecniche non è mai stato quello di quantificare il rilevamento di BDDE residuo a concentrazioni così basse come descriviamo in questo articolo (LOD del nostro metodo LC-MS = 10 ppb).
Orario di pubblicazione: 01-set-2021